操作步骤如下：

1. 细胞洗涤

在培养板中将已爬满细胞的玻片用PBS溶液浸洗3次，每次时长3分钟，以去除残留的培养基成分。

2. 细胞固定

使用4%的多聚甲醛固定爬片，时间为15分钟，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，以去除多余的固定液。

3. 通透处理

使用5% Triton X-100（与PBS混合）在室温下进行通透处理20分钟（如果细胞膜上表达抗原则可省略此步骤）。

4. 血清封闭

用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，随后用吸水纸吸干表面PBS，在玻片上滴加正常山羊血清（确保二抗来源为山羊），在室温下封闭30分钟。

5. 加入一抗

用吸水纸吸去封闭液，不进行洗涤。每张玻片上滴加足够渗透的一抗，并将其放入湿盒中，在4℃下避光孵育过夜。

6. 加入荧光二抗

用PBST溶液浸洗爬片3次，每次3分钟，随后吸水纸吸去多余液体，滴加已稀释的荧光二抗，在湿盒中于20-37℃下孵育1小时，最后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。注意：从加入荧光二抗开始，后续所有操作应尽量在较暗处进行。

7. 再次血清封闭

用吸水纸吸干液体，再次在玻片上滴加正常山羊血清（确保二抗来源为山羊），室温下封闭30分钟。

8. 加入第二种一抗

用吸水纸吸掉封闭液，不洗涤，接着滴加稀释好的第二种一抗。完成后，于4℃湿盒中避光孵育过夜。注意：第二种一抗的来源与第一种一抗必须不同，如小鼠与兔。

9. 添加第二种荧光二抗

用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸水纸吸干多余液体后加入稀释好的荧光二抗，在湿盒中20-37℃下孵育1小时，最后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。

注意：如果第一种抗体使用的是红色荧光，则第二种抗体必须选用不同颜色的荧光。

10. 核染色

滴加DAPI进行避光孵育5分钟以染核，用PBST洗去多余的DAPI（洗涤4次，每次5分钟）。

11. 封片处理

用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含有抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，最后在荧光显微镜下观察并采集图像。

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